無菌室應根據既經濟又科學的原則來設置。其基本要求有以下幾點：
1.無菌室應有內、外兩間，內間是無菌室，外間是緩沖室。房間容積不宜過大，以便于空氣滅菌。內間面積2×2.5＝5m2，外間面積1×2＝2m2，高以2.5m以下為宜，都應有天花板。
2.內間應當設拉門，以減少空氣的波動，門應設在離工作臺更遠的位置上；外間的門也用拉門，要設在距內間更遠的位置上。
3.在分隔內間與外間的墻壁或“隔扇”上，應開一個小窗，作接種過程中必要的內外傳遞物品的通道，以減少人員進出內間的次數，降低污染程度。小窗寬60cm、高40cm、厚30cm，內外都掛對拉的窗扇。
4.無菌室容積小而嚴密，使用一段時間后，室內溫度很高，故應設置通氣窗。通氣窗應設在內室進門處的頂棚上（即離工作臺更遠的位置），為雙層結構，外層為百葉窗，內層可用抽板式窗扇。通氣窗可在內室使用后、滅菌前開啟，以流通空氣。有條件可安裝恒溫恒濕機。
無菌室工作規程
1.無菌室滅菌。每次使用前開啟紫外線燈照射30min以上，或在使用前30min，對內外室用5%石炭酸噴霧。
2.用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室換上已滅菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液將手浸洗2分鐘。
3.將各種需用物品搬進內室清點、就位，用5%石炭酸在工作臺面上方和操作員站位空間噴霧，返回外室，5～10min后再進內室工作。
4.接種操作前，用70%酒精棉球擦手；進行無菌操作時，動作要輕緩，盡量減少空氣波動和地面揚塵。
5.工作中應注意安全。如遇棉塞著火，用手緊握或用濕布包裹熄滅，切勿用嘴吹，以免擴大燃燒；如遇有菌培養物灑落或打碎有菌容器時，應用浸潤5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸潤5%石炭酸的抹布擦拭臺面或地面，用酒精棉球擦手后再繼續操作。
6.工作結束，立即將臺面收拾干凈，將不應在無菌室存放的物品和廢棄物全部拿出無菌室后，對無菌室用5%石炭酸噴霧，或開紫外線燈照射30min。